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DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO:
PCR
 La técnica de la PCR permite la detección específica del DNA del virus de la PPA mediante la amplificación enzimática de un pequeño fragmento del genoma viral delimitado por una pareja de primers o cebadores específicos. El método de PCR descrito para VPPA emplea una pareja de primers diseñada en una región altamente conservada del genoma viral, la VP72, que asegura la detección de un amplio rango de aislados virales.
La PCR es una técnica rápida -puede completarse en menos de cuatro horas- y sensible, siendo capaz de detectar el virus incluso antes de la aparición de síntomas clínicos en los animales infectados. Además, la PCR puede aplicarse en cualquier muestra clínica (sobrenadante de cultivos celulares, sangre-EDTA, suero, homogeneizados de tejidos) y, especialmente, en aquéllas que han sido mal conservadas y que no son válidas para la detección de Ag o para el aislamiento viral.
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INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
La immunofluorescencia directa consiste en la detección del virus de la PPA en órganos o vísceras de animales sospechosos de sufrir la enfermedad.
La técnica se fundamenta en la unión del antígeno viral con anticuerpos específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Mediante el microscopio de fluorescencia se observan los complejos antígeno-anticuerpo positivos con fluorescencia. Esta técnica se utiliza desde 1968 para la detección del virus de la PPA y es capaz de detectar el antígeno viral en muestras de órganos de animales infectados.
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HEMOADSORCIÓN
 El aislamiento del virus de la PPA se realiza en cultivos primarios de macrófagos porcinos. El VPPA es capaz de infectar y replicarse de forma natural en cultivos de leucocitos de sangre periférica de cerdo, donde, además de producir un efecto citopático en los macrófagos infectados, previamente a la lisis celular origina un efecto característico de hemoadsorción (HAD), que consiste en la adsorción de los hematíes del cerdo alrededor de los leucocitos que han sido infectados por PPA.
La imagen al microscopio se presenta en forma de mórula o corona (roseta) de eritrocitos alrededor de los leucocitos.
SEMIPURIFICACIÓN DEL VPPA POR COLCHÓN DE SACAROSA
En la semipurificación del VPPA se obtienen diferentes proteínas virales, siendo la VP73 es la proteína estructural mayoritaria de la cápsida. Esta proteína induce anticuerpos en una infección natural; de ahí su importancia como reactivo para diferentes técnicas de diagnóstico. Otras proteínas importantes por su capacidad antigénica obtenidas tras el proceso de semipurificación son la proteína p32 y la proteína p54. Estas proteínas son parcialmente purificadas (junto con otras proteínas del VPPA) por simple extracción a partir de las partículas virales presentes en la fracción citoplasmática de células infectadas. El extracto de virus semipurificado es usado como antígeno efectivo para el diagnóstico de PPA mediante la técnica de ELISA e IB.
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DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO:
IMMUNOBLOTTING
Las proteínas virales del VPPA se separan electroforéticamente en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) a intensidad constante y se transfieren a membranas de nitrocelulosa. Rutinariamente la eficacia de la transferencia se comprueba mediante tinción del filtro con Rojo de Ponceau. La porción de filtro conteniendo las proteínas de interés es cortada en tiras de 3mm de ancho y se bloquean para saturar posibles sitios de unión inespecíficos a las proteínas. Después de bloquear se adicionan los sueros problema para permitir que los anticuerpos presentes reaccionen con el antígeno específico. La reacción se revela utilizando como conjugado proteína A peroxidasa. Los inmunocomplejos formados que permanecen en la tira de nitrocelulosa se detectan mediante la adición del sustrato de immunotransferencia (4-cloronaftol).
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ELISA INDIRECTO
El inmunoensayo ELISA es una técnica muy útil. Se utiliza ampliamente para el diagnóstico serológico de diferentes enfermedades animales. Algunos de las principales características son la alta sensibilidad, el alto grado de especificidad, su rapidez y el bajo coste.
Se pueden estudiar grandes poblaciones en cortos períodos de tiempo gracias a la actual automatización de los equipos. Los resultados son fácilmente interpretables.
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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
La IFI es un método de diagnóstico serológico en la que se combinan la sensibilidad de las técnicas histológicas y la especificidad de las técnicas inmunoenzimáticas.
La técnica está basada en la utilización de conjugados marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC), que poseen tanto actividad inmunológica como fluorescente. Como conjugado se puede utilizar un suero anti Ig-G de cerdo o bien proteína A marcada con FITC. Se ha descrito que usando proteína A se obtienen menos fondos inespecíficos.
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Técnicas de diagnóstico
